利用 ISO-SEQ 方法进行 RNA 测序

利用 Iso-Seq 利用 ISO-SEQ 方法进行 RNA 测序

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人类转录组研究

探索异构体使用的改变如何导致健康和疾病间的表型差异。

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动植物转录组研究

利用无需参考基因组的全长 cDNA 测序加速育种项目和基础研究。

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单细胞转录组研究

通过从单个细胞捕获全面完整的转录本序列,以更高的分辨率可视化生物学。

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利用 ISO-SEQ 方法进行 RNA 测序简介

利用长而准确的 HiFi read,可以表征转录组的完整多样性:

  • 发现可变起始位点和终止位点
  • 表征剪接事件
  • 鉴定等位基因特异性异构体
  • 以异构体分辨率分析表达

  • 检测融合基因
  • 预测全长开放阅读框
  • …等等

Iso-Seq method

“利用 Iso-Seq 可靠地检测到的超过 50% 的异构体无法用标准 RNA 测序方便地重现,强调了长读长测序鉴定异构体多样性的优势。”1

利用 ISO-SEQ 分析进行 RNA 测序实践

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利用分子内多重 cDNA 进行可扩展的 RNA 异构体测序

为进行可扩展的全长 RNA 测序,我们开发了多重化的芯片测序……

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肿瘤的RNA异构体全景

了解 PacBio 高度准确的长读长 RNA 测序如何在与癌症有关的 RNA 异构体领域创造的实质性的革命,并在本网络研讨会中了解癌症生物学的分子机制。

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应用教程

用HiFi Reads进行全长RNA测序简介

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ISO-SEQ 应用工作流程概览

基因组注释 全转录组 单细胞转录组
目标 高质量基因组注释 样本特异性参考转录组,用于异构体表达分析,有或无相关的短读长数据 鉴定细胞类型特异性异构体
文库构建 Iso-Seq 方案 Iso-Seq 方案 Mas-Seq protocol
测序 1 个 SMRT Cell 8M(建议多重分析多达 12 个组织) 每份样本 1 个 SMRT Cell 8M 1 SMRT Cell
分析 Iso-Seq 分析 (SMRTLink) 或命令行 (isoseq.how) Iso-Seq 分析,随后使用社区工具(SQANTI3、tappAS、Kallisto) Read 拆分结合SMRT Link 中的单细胞 Iso-Seq 分析“流程”,并兼容包括Seural,Scanpy,Kana在内的第三方分析工具。
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利用 ISO-SEQ 方法进行 RNA
测序的优势

Iso-Seq 方法由 HiFi reads 支持,揭示了其他方法遗漏的生物学信息。

ISO-SEQ 方法提供全长转录本异构体,无需组装

不同于短读长 RNA 测序方法,Iso-Seq 方法 reads 覆盖整个转录本,甚至能捕获非翻译区。

  • 检测可变多聚腺苷化
  • 检测不同异构体使用 (DIU)
  • 获得异构体水平的定相信息

Iso-seq method chart showing SNPs are inherited with Ki11 in only one version of the hybrid and that SNPs are inherited at 50/50 ratio despite the type of hybrid - PacBio

Wang, B. et al. (2020) Variant phasing and haplotypic expression from long-read sequencing in maize. Commun Biol.

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iso-method comprehensive - PacBio

图 3e 来自 Leung et al.(2021)

ISO-SEQ 数据十分全面

表征全转录组异构体多样性,揭示复杂可变剪接、融合事件以及转录通读。

ISO-SEQ 分析在单细胞水平提供了无与伦比的洞察力

使用任何单细胞平台制备全长 cDNA 作为 SMRT 测序的起始,在单细胞水平获得 Iso-Seq 用于群体 cDNA 相同的优势——完整转录本序列、异构体水平定相以及异构体分析。

Joglekar brain region graph - PacBio

Joglekar A, et al. (2021) A spatially resolved brain region and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun.

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Mas-Iso-Seq image - PacBio

技术开发焦点

MAS-ISO-SEQ 方法通过串联提供 >15× 的通量

 

我们在技术开发道路上步履不停。MAS-ISO-Seq 数据利用长而准确的 HiFi 读长的优势,通过 cDNA 分子的多重排列将 Iso-Seq 的通量提高 >15 倍。

访问 ASHG 观看 MAS-ISO-Seq 演讲 或者阅读预印本.

关于 PACBIO ISO-SEQ 方法和 RNA 测序的常见问题

Iso-Seq 方法指利用 PacBio SMRT 测序技术测序全长 cDNA。全长 cDNA 可由真核 RNA、细菌 RNA 甚至病毒 RNA 产生。由于全长 cDNA 在一个 HiFi reads 中测序,因此无需组装。

Iso-Seq 方法和生物信息学工作流程可产出 10 kb 及以上的高质量全长转录本序列。HiFi reads 的高准确度确保可鉴定 SNP,并且可将 UMI 和条码用于单细胞研究。

Iso-Seq 生物信息学分析工作流程不需要参考基因组,但是如果有参考基因组,可用于将全长转录本定位回基因组。

Iso-Seq 方法已被用于检测癌症融合基因。 实例包括在 B 细胞急性淋巴细胞白血病中鉴定 IGH-DUX4 融合和在SKBR3 细胞系中鉴定 3-hop 融合

单细胞 Iso-Seq (scIso-Seq) 方法已被用于多种产生全长单细胞分子的单细胞平台,并在诸如生后小鼠脑唐氏综合征老龄化脑的样本中揭示了基因水平短读长测序信息无法检测的细胞类型特异性异构体。

Iso-Seq 方法已被证明具有与匹配的短读长数据一致的基因水平表达,同时能识别利用基于短读长的转录本组装无法观察到的差异异构体使用 (DIU)。利用已有的 RNA 测序数据,Iso-Seq 方法可提供样本特异性异构体参考转录组,以改善异构体定量
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