随着另一种新的 SARS-CoV-2 变体的新闻成为头条，科学家发现需要一个真正全面的解决方案来识别和了解快速变异的病毒变得更加重要。
从 Alpha、Beta、Delta 到 Omicron，科学家和卫生官员一直在努力跟上新出现的病毒株，这些病毒株已使世界停滞近两年并导致近 550 万人死亡。
该病毒进化以适应人类生理，并通过其基因序列的突变来逃避免疫。 其中一些突变还破坏了我们用于检测和表征 SARS-CoV-2 的检测方法，因此了解每个新变体的含义对公共卫生至关重要。 传染性、疾病的严重程度、现有疫苗的功效以及新疫苗的开发都依赖于了解突变出现时的能力。
每种突变都以不同的方式影响病毒。 例如，SARS-CoV-2 刺突蛋白的 N501Y 突变可以使病毒更好地与人体细胞结合。 E484K 突变可能会降低 COVID-19 疫苗的有效性。
还有其他突变会影响使用基于 PCR 扩增子的方法进行测序所需的引物结合。 这些突变导致需要定期更新引物以跟上不断发展的病毒，而这些更新的发布速度可能很慢。 例如，许多商业解决方案中使用的 ARTIC V3 引物于 2021 年 6 月被 ARTIC V4 引物组取代，以解决 Beta (B.1.1.7) 和 Delta (B.1.617.2) 菌株的突变，以及 11 五个月后引入了新的引物以解决 Omicron (B.1.1.529)。
以下是迄今为止不同 SARS-CoV-2 变异谱系出现的简要时间表：
简单快捷的解决方案
最近，南非科学家能够克服这些挑战，并在发现变体后的短短几周内，使用 PacBio HiFiViral SARS-CoV-2 试剂盒成功地对 SARS-CoV-2 Omicron 谱系的整个基因组进行了测序。
Inqaba Biotec 团队使用新的 PacBio HiFiViral 试剂盒快速捕获整个病毒基因组，提供对公共卫生至关重要的信息。Inqaba Biotec 的生物信息学经理 Hamilton Ganesan 说：“我们能够在我们的实验室中成功地对 Omicron 进行测序，并可靠地完全覆盖整个基因组，包括负责刺突蛋白的高度突变基因。拥有这种分辨率水平以了解这种变体的全部影响非常重要。”
HiFiViral 试剂盒使用传统 PCR 富集的新型替代方案，可在 28-42 小时内快速获得结果——从 RNA 样本到分析结果，手动操作时间仅为 1-2.5 小时。
另一种方法涉及分子倒置探针 (MIP)，即包含与目标 DNA 互补的两个区域的单链 DNA 分子。 因为该过程使用约 1,000 个探针以 22 倍的覆盖率平铺基因组（每个碱基被 22 个探针覆盖），它已被证明对突变引起的序列丢失具有弹性。
为了评估 HiFiViral 试剂盒对高度突变变体的性能，根据阳性 PCR 测试中的扩增子丢失模式选择了 44 个可能具有广泛 Ct 值的 Omicron 样本。
其中，38 个样本可以分配到一个特定的谱系，其中 35 个是 Omicron。 如图 1 所示，绝大多数 Omicron 鉴定的样本具有 >99% 的基因组完整性。
比对完整和不完整 Omicron 样本的基因组共有序列显示，覆盖率低的样本中的间隙没有显示出一致的模式，这表明覆盖失败是样本质量差的结果，而不是由于 Omicron 谱系中的突变导致的系统性失败（图 2 ）。
此外，HiFiViral 试剂盒的性能与之前常见变体中的试剂盒性能相匹配，包括 Delta 和 Alpha（图 3），证明了这种基于 MIP 的方法是一种不需要定期更新和重新验证的稳定解决方案，尽管SARS-CoV-2变异迅速。
图 3. 来自四个不同站点的 HiFiViral Kit 数据显示了在主要由 Delta、主要由 Omicron 或不同谱系的混合组成的运行中的一致性能。 从左到右，运行有 96、384、896 或 44 个样本。
HiFi数据的优势
事实证明，将 MIP 与 HiFi reads相结合对于病毒基因组监控具有多个优势，而不仅限于检测各种变异的强大性能。
由于 HiFi reads长且准确，因此获得完整基因组覆盖所需的读取次数更少（使用 PacBio 需要约 1,000 条reads，而使用 Oxford Nanopore 需要约 10,000 条测序reads以获得 20 倍覆盖率或使用 Illumina 技术获得 10 倍覆盖率需要约 1,000,000 条reads）。此外，更少的reads意味着更简单的分析。
除了为研究人员提供更好的数据外，与其他技术相比，该试剂盒的工作流程需要更少的时间、劳动力和更少的塑料和其他消耗品——减少了在整个大流行期间挑战监测实验室的潜在供应链瓶颈。工作流程的简单性尤其吸引了Inqaba Biotec 的生物信息学经理Ganesan。
“它使我们能够以一种快速有效的方式处理、分析和扭转结果，这是我们无法从基于 PCR 扩增子的方法中获得的，” Ganesan说到。
由于每一步移液次数、板转移次数和颜色变化指示器的次数减少，工作流程的减少还减少了处理错误。
而且，该测序试剂盒提供了卓越的灵活性。它允许实验室扩展测试以满足不同的样本量和周转时间需求。使用 Sequel IIe 系统，用户可以在每个 SMRT Cell 8M 中同时检测24 – 384 个样本，或者加载多达 8 个 SMRT Cell，每周处理多达 3,072 个样本。
