重组腺相关病毒 (rAAV) 是最常被研究的基因治疗载体之一。在这种病毒的最基本的形式中，rAAV 载体的所有成分已被剥离，仅留下了侧翼反向末端重复 (ITR) 区域，用于在载体生产过程中引导基因组复制和包装。
使用 qPCR 或凝胶电泳的 rAAV 传统 QC 方法只能确认载体的大小分布，但无法识别它们的普遍性、片段化和成分。尽管二代测序已被用于进行 AAV 测序，但是，短读长无法对全长 AAV 分子进行测序，而全长 AAV 分子对于识别截短事件和嵌合体而言至关重要。ITR 区域也可以采用不同的触发器 (flip/flop) 配置，但如果缺乏全长信息，区分就会变得十分困难。
虽然其他长读长技术受到准确性的限制，无法解析类似的 AAV 种类并量化其普遍性，但 PacBio SMRT 测序能够生成准确的长 read (HiFi read)，可以对 AAV 基因组进行从 ITR 到 ITR 的测序，从而揭示其他方法难以检出的问题。
了解如何在 AAV 载体开发的不同阶段利用 HiFi 测序：
HiFi 测序用于 AAV 载体发现
源自人类病毒组的新型衣壳可以作为候选治疗工具。Hsu 等人 (2020) 通过对单个组织进行 HiFi 测序发现了一种新型衣壳 (AAVv66)，它与市场上常见的 AAV2 相似，但在产量、病毒体稳定性和 CNS 转导方面均有提升。 这种新型衣壳是研究人员通过使用在血清型的保守区域内设计的引物进行靶向测序发现的。值得注意的是，通过对目标区域（约 2.2 kb）进行全长、高精准度测序，研究人员发现并量化了样本中不同的新型 AAV 种类，从而识别出了在群体中占主导地位 (45%) 的新型衣壳 AAVv66。
HiFi 测序用于 AAV 载体设计
对全长 AAV 进行测序不仅能够为载体设计提供信息，而且还能揭示通过其他方法无法观察到的包装问题。Tai 等人 (2018) 通过 HiFi 测序发现，一个看似同质的基因组群实际上仅包含不到 50% 的全长序列。 具体而言，他们对一组自补 AAV (scAAV) 进行了测序，发现包含短发卡式 DNA 的情形会导致不利的基因组截短。同样，在后续发表的一篇论文（Tran 等人，2020）中，研究人员发现，在尾接尾配置中包含两个单向导 RNA (sgRNA) 表达盒会导致 ssAAV 中的包装截短。在这两项研究中，HiFi 测序均发现了杂质，例如，源自质粒骨架的序列以及源自包装和辅助质粒的序列。
因此，HiFi 测序可以通过观察截短、片段化和其他非全长异常序列的频率来反复改进载体设计。此外，为了确认转基因能够产生所需的 mRNA 转录本，可以利用靶向全长异构体测序（靶向Iso-Seq 方法）来表征和量化表达的异构体。
HiFi 测序用于宿主整合研究
要想创建安全的基因治疗产品，了解潜在的宿主整合事件也十分重要。Dalwadi 等人 (2021) 利用 HiFi 测序研究了 rAAV 进入人类肝细胞的频率，他们在体外和体内研究中均发现，发生染色体整合的频率竟然高达 1% 至 3%。 重要的是，大多数插入的 rAAV 序列发生明显重排，而且在整合位点存在宿主基因组序列缺失的情况。
HiFi 测序用于 AAV 生产
最近，Tran 等人 (2022) 表示，不同的生产平台能够产生不同的 AAV 基因组群。 他们通过 HiFi 测序发现，与 pTx/HEK293 相比，rBV/Sf9 生成的载体由于截短、自补的单个 ITR 序列而含有更大比例的未解析基因组。此外，测序还发现，以前被认为是空衣壳的物质其实含有携带 ITR 的短 DNA 片段。这一发现对依赖 qPCR 或 ddPCR 的标准临床生产具有影响，因为 qPCR 或 ddPCR 以 ITR 附近的序列为基础量化载体滴度。最后，作者表示，无论使用何种生产平台，ITR 的异质性都会直接影响基因组群。
总结
目前，基因治疗正处于一个拐点。高准确度和完全可见性对于基因治疗产品的新型载体发现、载体设计和生产质量控制的成功至关重要。研究人员利用 HiFi 测序对不同生产系统中的 ssAAV 和 scAAV 进行了表征和量化，发现了以前未知的、可能对安全性和功效产生重要影响的部分衣壳或空衣壳问题。同时，人类病毒组包含更多可以通过测序发现的候选治疗工具。
