在处理生命周期短且繁殖速度快的昆虫、真菌和微生物时，经常会遇到在单一种群中存在高度可变的遗传学问题。 这些种群中遗传学的复杂性，是研究入侵物种和农业害虫的研究人员与实地科学家们面临的众多挑战之一。
幸运的是，HiFi 测序已成为一种方便的工具，可帮助研究人员找到昆虫、真菌和微生物中负责免疫、代谢解毒和抗杀虫剂的新型基因。
使用 HiFi 测序组装害虫的参考基因组
USDA Agricultural Research Service（美国农业部农业研究服务署）利用 HiFi 测序，从各种大小的单个昆虫标本中开发低成本、高质量的参考基因组，并且这些参考基因组的开发工作随着时间的推移而不断完善。
当 Ag100Pest 计划于 2018 年启动时，通过 NCBI 获得的 366 个节肢动物基因组中仅有 6 个 (1.6%) 符合高标准连续性要求。
顾名思义，该联盟最初计划生成 100 种害虫或潜在害虫的参考基因组组装，但随着时间的推移，该计划也在不断发展，目前共有 158 个物种正在筹备中。
昆虫对农业的威胁早为人知，但它们对生产的影响，极大地受到杀虫剂使用、气候变化以及通过全球贸易将非本土昆虫引入新栖息地的影响。 如今，害虫已经广泛产生杀虫剂抗性，本土害虫的季节性活动扩大增加了对地理景观的破坏，非本土害虫在栖息地之间的迁移也给生态系统带来了挑战。
“毫无疑问，我们控制节肢动物害虫的能力也必须进化和适应，以减轻这些威胁，而特别是基因组学有望促进创新和弹性控制技术的发展。”Ag100Pest 领导人在 2021 年的一篇论文中写道。
很明显，高质量的基因组组装是他们工作里不可缺少的一环。
“最近的估计表明，生物体中近 90% 的经济或生态重要特征可能是由基因组非编码区域变异决定的，这表明需要高质量的参考基因组组装来研究与害虫管理相关的特征。”文中写道。
作者特别提到，PacBio 的标准起始量实验方案和 HiFi reads 精准度是“该计划成功的关键”。
通过降低 DNA 起始量要求，PacBio 的新工作流程比以往任何时候都更容易获得 DNA，即使是最小生物体也是如此。
这些进步所带来的益处可能超出想象，包括可通过在环境可持续性害虫管理实践的功效和持久性方面取得的技术进步，支持生物经济的发展。例如，新型分子管理工具在有效靶向害虫的同时可避免环境破坏，特别是对有益节肢动物种群的破坏。
“提高盈利能力，同时减少农业生产对环境的任何负面影响，将直接有利于农村经济、社会福祉和人类整体健康。”他们总结道。
PacBio 检测在世界各地的实践应用
随着欧盟对农药登记和使用的限制越来越多，确保现有杀菌剂保持杀菌效果至关重要。 因此，了解靶标病原体种群中杀菌剂抗性的动态是全球害虫综合管理计划的主要支柱。
在某些情况下，杀虫剂和杀菌剂抗性通过靶位点突变实现，病原体通过累积多个靶位点变化来适应药性。 通过对靶位点基因变化的分子检测来监测抗性，是一种有价值的方式。
爱尔兰、瑞典、丹麦和比利时的一组研究人员在他们对子囊真菌 (Zymoseptoria tritici) 的研究中采用了这种方法，子囊真菌会导致小麦黑斑病 (STB)，一种对整个西欧和北欧冬小麦而言最具破坏性的病害。
正如他们在 《Frontiers in Microbiology》 的这篇文章 中所述，研究人员创建了一种基于靶基因多重扩增的 PacBio 长读长测序分析，能够同时检测多个区域的改变，研究人员认为这些区域在使子囊真菌 (Z. Tritici) 对三种类型的杀菌剂产生抗性方面发挥了作用。
在一个 SMRT 细胞中对来自两个多重 PCR（包含来自 96 个分离株的 14 个不同扩增子）的合并 PCR 产物进行测序。
此外，研究人员还对 9 个管家基因以及与杀菌剂抗性相关的基因进行了多重扩增和测序，以提供全面的子囊真菌 (Z. tritici) 菌株基因分型。
通过该检测，研究人员能够加深对病原体生物学及其未来应用潜在用途的理解。
“当充分利用其在大量分离物中筛查多个靶标的能力时，与传统的 Sanger 测序相比，每个菌株的成本预计会大幅降低，”他们总结道。
Iso-Seq 分析的见解
生物获得抗性的另一种方式可通过可变剪切实现，可变剪切是真核生物中的一个共同特征，可增加转录本的多样性并产生功能性后果。
在昆虫中，已经发现可变剪切与对杀虫剂和 Bt 毒素的抗性有关，密苏里州的研究人员很想知道它是否在西部玉米根虫 (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) 的 Bt 抗性中发挥了作用，据估计，西部玉米根虫每年会给美国玉米生产带来 14 亿美元的损失。
正如 Royal Entomological Society（皇家昆虫学会）的《Insect Molecular Biology》杂志中所报道，该团队对西部玉米根虫初孵幼虫中肠进行了单分子实时 (SMRT) 转录本测序和 Iso-Seq 分析，结果表明，根虫中肠以含有和不含有转基因玉米 (Cry3.1Ab) 中存在的嵌合蛋白的玉米幼苗为食。
该团队结合使用 RNA-seq 和 Iso-Seq 转录测序技术，分析了根虫中肠响应于以表达 eCry3.1Ab 的玉米为食的转录组范围的可变剪切模式。
地球是由微生物、植物和动物等一系列生命体相互交织形成的生态系统。 这些生态系统的每一部分，都在支持地球以及居住在地球上的居民的生活和福祉方面都发挥着各自的作用。 为了更好地了解入侵物种并保护我们的农作物和牲畜免受病虫害，研究人员需要可靠的参考基因组——在这一点上 HiFi 测序可以提供帮助。
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